ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA TERPENOID YANG AKTIF ANTIBAKTERI PADA HERBA MENIRAN (Phyllanthus niruri Linn)

A.      ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : neraca analitik, blender, labu erlenmeyer, penguap putar vakum, pipet ukur, labu ukur, corong pisah, botol reagen, kertas saring, seperangkat alat gelas, seperangkat alat kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi gas-spektroskopi massa, refluks, sokhlet dan lampu ultra violet 254 nm dan 366 nm.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah seluruh bagian herba meniran segar (Phyllanthus niruri Linn) yang diperoleh dari Kelurahan Kerobokan Kelod, Kecamatan Kuta Utara, Kabupaten Badung, Propinsi Bali. Herba meniran dikeringkan kemudian diblender sampai berbentuk serbuk. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian terdiri dari metanol (p.a), asam asetat anhidrida (p.a), H2SO4 pekat, kloroform (p.a), nheksana (p.a), benzena (p.a), KOH 10%, kalsium klorida anhidrat, HCl 4 M, kalium bromida, silika GF254, silika G60, akuades.

B.       METODE KERJA

1.         Ekstraksi

Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan dengan dua cara yaitu :

a.       Sokletasi

Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran disokletasi dengan 5 L pelarut n –heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.

b.      Maserasi

Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran dimaserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dihidrolisis dalam 100 mL HCl 4 M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan 5 x 50 mL n–heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.

2.     Uji aktivitas antibakteri

Ekstrak n-heksanaa diuji aktivitasnya terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphyloccocus aureus dengan tahap – tahap sebagai berikut :

a.       Diambil sebanyak satu koloni biakan bakteri Eschericia coli dengan menggunkan jarum ose yang dilakukan secara aseptis.

b.      Dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2 mL Mueller-Hinton broth kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC .

c.       Suspensi bakteri homogen yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Mueller-Hinton agar, secara merata dengan menggunakan lidi kapas yang steril.

d.      Kemudian ditempelkan disk yang berisi sampel, standar tetrasiklin serta pelarutnya (n-heksana) yang digunakan sebagai kontrol.

e.       Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC .

f.       Dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap bakteri.

g.      Untuk biakan bakteri Staphyloccocus aureus dilakukan dengan cara yang sama seperti biakan bakteri Eschericia coli, namun suhunya berbeda yaitu pada suhu 37ºC

Ekstrak yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dipisahkan mengunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 dan fase gerak kloroform : metanol (3 : 7). Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri. Fraksi yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dilanjutkan ke tahap pemurnian menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang relatif murni selanjutnya diidentifikasi menggunakan kromatogafi gas – spektroskopi massa.

C.      HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ekstraksi dengan cara sokletasi dan maserasi menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana pada kedua cara tersebut positif mengandung senyawa terpenoid. Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya warna ungu setelah ekstrak nheksana direaksikan dengan Pereaksi Lieberman Burchard. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi memberikan daya hambat yang lebih besar dibandingkan ekstrak n-heksana hasil maserasi. Terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi dipisahkan mengunakan kromatografi kolom menghasilkan tiga buah fraksi yang dipaparkan pada Tabel 1.

No	Fraksi	Jumlah Noda	Rf	Warna Ekstrak
1	A	1	0,725	Kuning
2	B	2	0,690 dan 0,600	Kuning muda
3	C	1	0,580	Kuning muda

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi A dan fraksi C positif terpenoid yaitu memberikan warna merah muda (positif diterpenoid) pada fraksi A dan warna ungu muda (positif triterpenoid) pada fraksi C setelah direaksikan dengan pereksi Lieberman-Burchard. Hasil ini dipaparkan pada Tabel 2.

Nama Fraksi	Warna larutan sebelum direaksikan dengan pereaksi Liberman-Burchad	Warna larutan setelah direaksikan dengan pereaksi Liberman-Burchad	Keterangan
Fraksi A	Kuning	Merah  muda	Positif terpenoid (diterpenoid)
Fraksi B	Kuning muda	Hijau kebiruan	Negative terpenoid (steroid)
Fraksi C	Kuning muda	Ungu muda	Positif terpenoid(triterpenoid)

Fraksi yang positif terpenoid selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri. Dari hasil uji aktivitas antibakteri fraksi A memberikan daya hambat yang lebih baik sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap pemurnian. Hasil pemurnian menunjukkan noda tunggal. Hal ini dapat dikatakan fraksi A relative murni secara KLT. Isolat yang relatif murni diidentifikasi menggunakan kromatografi gas – spektroskopi massa. Kromatogram gas fraksi n-heksana positif terpenoid dan aktif antibakteri yang menunjukkan terdapatnya dua buah puncak dengan waktu retensi berturut-turut : 25,74 dan 21,93 menit. Berdasarkan data di atas senyawa tersebut mengandung dua buah senyawa.

Setelah difragmentasi, struktur phytadiene mengikuti pola fragmentasi senyawa pada puncak I, dengan demikian senyawa pada puncak I diduga sebagai senyawa phytadieneberdasarkan data Spektroskopi Massa, pola fragmentasi dan hubungan antara senyawa puncak I dengan phytol, phytadiene dan dodekane.

Berdasarkan data hasil penelusuran internet, terdapat struktur senyawa yang memiliki berat molekul m/z 336 dengan gugus dan pola fragmentasi yang memenuhi gugus dan pola fragmentasi senyawa pada puncak II, senyawa tersebut adalah 1,2-seco-cladiellan. Berdasarkan data di atas ditarik suatu kesimpulan yaitu senyawa puncak II diduga sebagai senyawa 1,2–seco–cladiellan, karena struktur senyawa ini memenuhi pola fragmentasi senyawa puncak II.

D.      KESIMPULAN

Penelitian Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Terpenoid Yang Aktif Antibakteri Pada Herba Meniran (Phyllanthus niruri Linn) dengan perlakuan awal ekstraksi, kemudian dipisahkan dengan kromatografi kolom, dimurnikan dengan kromatografi lapis tipis dan selanjutnya diidentifikasi menggunakan kromatogafi gas – spektroskopi massa disimpulkan bahwa Herba meniran (Phyllanthus niruri Linn)mengandung dua senyawa terpenoid yang diduga jenis phytadiene dan 1,2-seco cladiellan.